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MOREIRA, Gláucia Bethânia Rocha. Diversidade genética e estabelecimento de protocolo para micropropagação de Tectona grandis. 2012. 96 p. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal no Semiárido) – Universidade Estadual de Montes Claros, Janaúba, 2012.
Como estratégia do melhoramento, a propagação “in vitro” permite a obtenção de um grande número de plântulas em um curto período de tempo e estudos de diversidade genética também devem ser praticados na população a ser melhorada com a utilização de marcadores moleculares. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um protocolo para o estabelecimento “in vitro” de explantes de teca, bem como avaliar a diversidade genética de acessos por meio do uso de marcadores moleculares ISSR e RAPD. Meristemas apicais e gemas laterais foram coletados a partir de plantas de teca com 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 anos de idade. Os explantes foram submetidos à assepsia com lavagem em água e detergente neutro, seguida de lavagem em hipoclorito de sódio 2,5%. Após a etapa de assepsia os meristemas apicais e gemas laterais foram retirados com o auxílio de bisturi e introduzidos em frascos contendo meio MS, suplementado e colocados em câmara escura por dez dias, posteriormente foram transferidos para sala de cultivo na presença de luz. Após trinta dias os explantes foram avaliados quanto à porcentagem de sobrevivência. Após a etapa de seleção do tipo e idade do explante, meristemas apicais de 2,5 anos de idade foram cultivados em meio MS adicionado de 6-BAP (1,25; 1,75; 2,25 e 2,75 mL L-1 ) e cinetina 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 mL L -1 . O intervalo de repicagens foi de 30 dias. As características avaliadas foram: comprimento de brotos, número de folhas, tamanho e presença de calos. O delineamento foi o inteiramente casualizado. Os dados foram submetidos a análise de variância. Para os trabalhos analisando a diversidade genética, foram coletados genótipos de dois plantios comerciais de teca no Norte de Minas Gerais. Para amplificação foram utilizados 10 primers RAPD e 11 primers ISSR. Um total de 71 e 36 locos polimórficos foram gerados respectivamente e com heterozigosidade média esperada de 0,75 com o RAPD e 0,57 com ISSR e distância genética de 0,27 e 0,15 respectivamente. Apesar da elevada heterozigosidade média esperada, observou-se baixa distância genética entre os indivíduos avaliados. Pela análise do dendrograma obtido com o índice de Jaccard, observa-se a formação de cinco grupos com a utilização dos primers RAPD. Dois grupos com um genótipo cada um, outro grupo com 4 genótipos, outro com 26 genótipos e o quinto com 32 genótipos. Oito grupos foram gerados com a utilização dos primers ISSR (Grupo I e II com um genótipo cada um; Grupo III com cinco genótipos; Grupo IV com quatro genótipos; Grupo V com 1 genótipo; Grupo VI com sete genótipos; Grupo VII com doze genótipos e Grupo VIII com 20 genótipos). Observou-se que o acesso S 27 foi o mais distante com a utilização do RAPD e o acesso S 44 com a utilização do ISSR. O valor cofenético calculado para o RAPD foi de 0,93 e para o ISSR 0,71 refletindo uma boa concordância com os valores de similaridade genética. O tipo de explante mais apropriado para estabelecimento da teca é do tipo apical e a idade variando de um ano e meio a dois anos e meio. Os reguladores de crescimento utilizados não foram eficientes para a multiplicação de teca. Os primers RAPD e ISSR são eficientes para condução de estudos sobre diversidade genética em teca e os indivíduos avaliados apresentam baixa diversidade genética entre si.
Palavras-chave: Citocininas; Oxidação; Variabilidade genética; RAPD; ISSR.
Genetic diversity and protocol establishment for micropropagation of Tectona grandis
As breeding strategy, "in vitro" propagation allows obtaining a large number of plantlets in a short period of time, and studies on genetic diversity also should be practiced in the population to be enhanced by the use of molecular markers. The aim of this study was to develop a protocol for the establishment "in vitro" of teak explants, as well to assess the genetic diversity of accessions by means of ISSR and RAPD molecular markers Apical meristems and lateral buds were collected from teak plant with 1.5, 2.0, 2.5 and 3.0 years old. The explants were subjected to cleaning with sterile water and neutral detergent, followed by cleaning in 2.5% sodium hypochlorite. After the sterilization, the lateral buds and apical meristems were removed with the aid of a scalpel and placed in vials containing MS medium, supplemented and placed in a dark chamber for ten days, later they were transferred to culture room in the presence of light. After thirty days the explants were evaluated as for percentage of survival. After selecting the type and age of the explants, apical meristems of 2.5 years old were cultivated in MS medium with 6-BAP (1.25, 1.75, 2.25 and 2.75 mL L -1 ) and Kinetin 1.0, 1.5, 2.0 and 2.5 mL L-1 .The interval of subculture was every 30 days. The evaluated characteristics were: shoots length, leaf number, size and presence of callus. The experimental design was completely randomized. The data were subjected to analysis of variance. For works analyzing the genetic diversity, genotypes were collected from two commercial plantations of teak in the North of Minas Gerais. For amplification 10 RAPD primers and 11 ISSR primers were used. A total of 71 and 36 polymorphic loci was generated respectively, and average heterozygosity of 0.75 with RAPD and 0.57 with ISSR and genetic distance of 0.27 and 0.15 respectively. Despite the high average heterozygosity expected, it was observed a low genetic distance between individuals evaluated. By analysis of dendrogram obtained with the Jaccard index, it was observed the formation of five groups using the RAPD primer. Two groups with one genotype each one, another group with 4 genotypes, another one with 26 genotypes and the fifth with 32 genotypes). Eight groups were generated using the ISSR primers (Group I and II with one genotype each one, Group III with five genotypes; Group IV with four genotypes; Group V with 1 genotype; Group VI with seven genotypes; Group VII with twelve genotypes and group VIII with 20 genotypes). It was noticed that the S-27 accession was further one using the RAPD and the S 44 accession using the ISSR. The co-phenetic value calculated for RAPD was 0.93 and 0.71 for ISSR reflecting a good agreement with the values of genetic similarity. The most suitable type of explant for micropropagation of teak is the apical one and the age ranging from one and a half to two and a half years. The growth regulators used in this work were not effective for the multiplication of teak. The RAPD and ISSR primers are effective for conducting studies on genetic diversity in teak and the evaluated individuals show low genetic diversity among themselves
Keywords: Cytokinins; Oxidation; Genetic variability, RAPD; ISSR.
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